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最近在《Journal of Cell Biology》发表的一项研究中，美国麻省大学医学院的科学家，揭示了“CRISPR-Cas9机器在活细胞内如何运作”的重要新细节，对于开发使用强大基因编辑工具的治疗方法，具有重要的意义。

本文通讯作者、生物化学与分子药理学教授Thoru Pederson博士说：“关于‘CRISPR-Cas9复合物如何在活细胞的基因组周围四处活动并发现其靶标’的细节，我们了解甚少。在这项研究中，我们了解到这台机器是如何工作的，这对于试图开发基因编辑工具用于实验室和临床的研究者来说，是非常重要的和有用的。”

作为该细菌免疫系统（防止病毒入侵）的一个组件，CRISPR-Cas9复合物是一种强大的基因编辑系统。CRISPR-Cas9适于在实验室里，它比以前的技术更有效和精确，因为科学家们能找到方法，快速地编程和传递它，以选择性地编辑用于研究的特定基因序列。为了切割一段双链DNA，CRISPR-Cas9利用一段大约20个碱基对的向导RNA，来靶定基因组的特定靶区域，然后，Cas9复合物将进行切割。这使得科学家能够切除基因组中的基因序列，或向基因组中插入基因序列。

CRISPR/Cas9系统在活细胞内如何运作的根本动力学，我们还不清楚，一些传递系统和技术已经比其他的更为成功。为了观察CRISPR-Cas9系统在一个活细胞内是如何运作的，Pederson博士和同事们开发了一种技术，能用不同的荧光分子来标记导向RNA和Cas9元件，这样就可以同时跟踪它们。

他们发现，向导RNA——当不结合Cas9时，是极其短暂的。当Cas9和向导RNA进行组装时，该复合物要稳定得多，大约有一半其一生（大概十五分钟）是在细胞核内，其余的则更为稳定。

本文共同第一作者、Pederson实验室的研究专家马涵慧（Hanhui Ma）博士指出：“Cas9可使导向RNA稳定。如果你分别将向导RNA和Cas9传递入细胞，以让它们进行组装，它将不会那么的有效，因为一些向导RNA会降解。如果你把它们都传递到细胞内，已经组装，你会看到更多的活性。”马博士早年毕业于中国科学院上海生命科学研究院。

其他的研究成员——包括RNA疗法研究所助理教授David Grunwald博士，Grunwald实验室博士后Li-Chun Tu博士发现，通过Cas9引导性RNA复合物的靶标停留持续时间，决定着DNA是否将被切割。当向导RNA序列与靶DNA序列完全匹配时，这种Cas9引导性RNA复合物在离开之前仍然结合长达两小时的时间，同时切割完成。如果是不匹配的引导性RNA靶向DNA序列，该复合物只会持续几分钟的时间，并且切割受损。

马博士说，知道了这一点，科学家就有可能通过数学方法，根据CRISPR位于基因组上多久，来预测脱靶切割可能发生在哪里。马博士补充说：“我们仍然不知道CRISPR的规则。每个人都想知道，当它进入一个活细胞时会发生什么。这项研究有助于写一篇《操作手册》。”

在今年4月，这个研究小组开发出了一项利用CRISPR/Cas9的新技术：CRISPRainbow，它使得研究人员能够在活细胞中标记和追踪7个不同的基因组位点。这一标记系统将成为实时研究基因组结构的一个宝贵的工具，研究人员在《自然生物技术》（Nature Biotechnology）发布了关于它的详细资料。

而在2015年《PNAS》发表的一项研究中，马涵慧博士带领研究人员，利用来自三种细菌直系同源物的催化失活Cas核酸内切酶（dCas9），设计了一种基于CRISPR的多色荧光标记系统，可特定而有区别地同时标记不同对的染色体位点。每对dCas9-荧光蛋白和同源单导向RNAs（sgRNAs），可有效地标记人活细胞内的几个靶位点。从而可让我们评估活细胞中位点之间的距离。

来源：生物通/王英

推荐原文摘要：

CRISPR-Cas9 nuclear dynamics and target recognition in living cells

Abstract: The bacterial CRISPR-Cas9 system has been repurposed for genome engineering, transc rIPtion modulation, and chromosome imaging in eukaryotic cells. However, the nuclear dynamics of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)–associated protein 9 (Cas9) guide RNAs and target interrogation are not well defined in living cells. Here, we deployed a dual-color CRISPR system to directly measure the stability of both Cas9 and guide RNA. We found that Cas9 is essential for guide RNA stability and that the nuclear Cas9–guide RNA complex levels limit the targeting efficiency. Fluorescence recovery after photobleaching measurements revealed that single mismatches in the guide RNA seed sequence reduce the target residence time from >3 h to as low as <2 min in a nucleotide identity- and position-dependent manner. We further show that the duration of target residence correlates with cleavage activity. These results reveal that CRISPR discriminates between genuine versus mismatched targets for genome editing via radical alterations in residence time.

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